By Stefan Haberstock博士

　　借助熒光檢測(cè)技術(shù)您可以進(jìn)行一些極端敏感，高穩(wěn)健性且具有廣泛動(dòng)態(tài)范圍的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，而試驗(yàn)的成功取決于下文所述的幾點(diǎn)：激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）和發(fā)射波長(zhǎng)（Em）的謹(jǐn)慎選擇，靈活敏感的光學(xué)器件的選用。

　　優(yōu)化熒光檢測(cè)—熒光信號(hào)的最大化，背景干擾的最小化和任何一種檢測(cè)方法一樣，熒光測(cè)量法成功的關(guān)鍵就在于通過(guò)提高信號(hào)噪聲比（S/N）來(lái)實(shí)現(xiàn)靈敏度的提高。在特定的測(cè)量過(guò)程中，S/N比極大地取決于染料激發(fā)（Ex）和發(fā)射（Em）波長(zhǎng)的特點(diǎn)以及使用時(shí)設(shè)置的波長(zhǎng)和帶寬。

　　每一個(gè)熒光基團(tuán)都有Ex光譜, 而正是Ex光譜能決定哪些照明波長(zhǎng)可以用來(lái)最大限度地激發(fā)該基團(tuán)。反過(guò)來(lái)講, 熒光基團(tuán)的Em光譜能決定熒光最強(qiáng)時(shí)的波長(zhǎng)。兩個(gè)（Ex和Em）最優(yōu)波長(zhǎng)之間的差異叫做斯托克斯位移。

　　斯托克斯位移是熒光檢測(cè)高靈敏度的基礎(chǔ)

使用適當(dāng)波長(zhǎng)的濾光片或可以自主選擇波長(zhǎng)的光柵，我們可以將Ex和Em設(shè)置為與最適宜染料相同或相似的波長(zhǎng)。選擇最優(yōu)波長(zhǎng)的精準(zhǔn)度取決于帶寬。例如，帶寬為20nm的光柵，設(shè)置其波長(zhǎng)為450nm，那么它會(huì)讓波長(zhǎng)在 440-460nm之間的光束通過(guò)。

　　帶寬決定了波長(zhǎng)選擇的精確度。帶寬20nm意味著在高斯曲線高度的一半處波長(zhǎng)為+10nm，而在曲線底部波長(zhǎng)將會(huì)是+20nm。

　　當(dāng)染料的斯托克斯位移小于帶寬之和（Ex + Em）時(shí)，對(duì)最優(yōu)Ex和Em的選擇很可能導(dǎo)致間隔或重疊。也就是說(shuō)，用于Ex的光束將會(huì)通過(guò)Em濾光片或光柵到達(dá)光電倍增管（PMT），導(dǎo)致錯(cuò)誤的假陽(yáng)性結(jié)果。

　　Ex和Em帶寬的重疊導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果

　　因?yàn)楠M窄的帶寬總能使最優(yōu)Ex和Em被選入，所以窄帶寬看上去是更為可取的。但狹窄的帶寬也降低了能量輸入、檢測(cè)限度和S/N比。大多數(shù)情況下，當(dāng)Ex和Em的帶寬在15–20nm左右，且波長(zhǎng)設(shè)置不以優(yōu)化Ex和Em為目的的時(shí)候，儀器能提供最佳的檢測(cè)限度和S/N比。

　　以Ex和Em帶寬間的最佳距離（Ex + Em + 5nm）設(shè)置波長(zhǎng)，來(lái)防止重疊并產(chǎn)生最佳的檢測(cè)限度和S/N比。

　　熒光基團(tuán)會(huì)受所處環(huán)境影響

  染料的Ex和Em特性能被與其結(jié)合的分子以及所處環(huán)境的理化性質(zhì)所影響。環(huán)境因素包括溫度，離子強(qiáng)度和pH值。因此，優(yōu)化檢測(cè)方案應(yīng)包括應(yīng)用光柵掃描Ex和Em，以確定在某特定條件下染料的最佳Ex和Em值。

一般來(lái)說(shuō)，光柵的靈敏度要低于濾光片，這進(jìn)一步導(dǎo)致了我們?cè)陂_發(fā)檢測(cè)方案的過(guò)程中對(duì)靈敏度的要求的降低。通常情況下，在一次測(cè)量過(guò)程中我們僅掃描Ex和Em的帶寬。因此，當(dāng)我們使用濾光片記錄染料最大激發(fā)波長(zhǎng)或發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)，理想化的光學(xué)系統(tǒng)將會(huì)是濾光片和光柵的組合。

強(qiáng)大的多重分析技術(shù)，需要強(qiáng)大的光電倍增管支持

多重樣本分析的熒光檢測(cè)技術(shù)能夠在多種情況下使熒光檢測(cè)技術(shù)成為一種選擇。但如上文所述，光譜的重疊能通過(guò)引入干擾而降低檢測(cè)的靈敏度。尤其是在一次檢測(cè)中使用多種染料（多重分析） 的情況下，這一點(diǎn)變得更為重要，并且我們需要特別注意對(duì)染料的選擇。由于熒光技術(shù)的廣泛普及，許多染料和許多版本的熒光蛋白現(xiàn)已可以讓我們?cè)谌庾V范圍中使用。

在本文中，光電倍增管 (PMT) 的光譜性能顯得尤為重要。許多PMT已為熒光技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，能在發(fā)出波長(zhǎng)在500nm上下的綠光。但是，那些能夠發(fā)射波長(zhǎng)超過(guò)600nm紅光的染料對(duì)優(yōu)化后的PMT仍是一個(gè)難題。這就可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)敏感性的顯著降低，而作為補(bǔ)償，我們需要使用更高濃度的反應(yīng)物，進(jìn)而增加了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用且降低了檢測(cè)技術(shù)的魯棒性。如果您想進(jìn)行多重樣本分析的話，您需要對(duì)PMT的光譜響應(yīng)多加留意。